LAPORAN
PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI
PANGAN
Kelompok
2
Parlindungan Teguh Steven 240210150074
Hayu Lesya Putri 240210150075
Violita Widyaningtyas 240210150076
Bayu Airlangga 240210150077
Indah Medani K.A.P 240210150078
Adira Dwi Rahmi 240210150079
UNIVERSITAS PADJADJARAN
FAKULTAS TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN
DEPARTEMEN TEKNOLOGI INDUSTRI PANGAN
JATINANGOR
2016
BAB I
PENDAHULUAN
1.1
Teori Dasar
Media
kultur bakteri adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi atau
zat-zat hara (nutrisi) yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di atas
atau di dalamnya. Selain itu, media kultur mikroba dapat dipergunakan pula
untuk isolasi, perbanyakan, pengujuan sifat-sifat fisiologis, dan perhitungan
jumlah mikroorganisme (Sumarsih, 2003).
Media
kultur yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme ada dalam bentuk padat,
semi padat, dan cair. Media kultur padat diperoleh dengan menambahkan agar-agar. Agar-agar berasal dari ekstrak
ganggang merah. Kandungan galaktan pada agar-agar sebagai zat pemadat adalah
1,5%-2,0% dan membeku pada suhu 45⁰C. Agar-agar sulit
diurai oleh bakteri (Utami, 2004).
Untuk
media kultur semi-padat dan cair ada perbedaan dalam penggunaan pemadat dalam
unsur medianya. Di media kultur semi padat zat pemadat seperti agar hanya dalam
komposisi yang kecil sehingga pemadatan hanya akan terjadi sedikit atau
sebagian. Adanya bagian yang tidak memadat atau tetap dalam keadaan cair juga
bertujuan untuk ditujukan kepada beberapa jenis mikroba.
Untuk
media kultur cair, penggunaan zat pemadat tidak ada sama sekali. sehingga media
memiliki kandungan air yang sangat banyak. Media ini juga ada karena ditujukan
untuk mikroba yang hidup di air dan juga ditujukan pada kultur mikroalga.
Media
pertumbuhan bakteri atau media kultur bakteri adalah cairan atau gel yang di desain
untuk mendukung pertumbuhan mikroorganisme dan sel. Terdapat dua jenis
utama media pertumbuhan yaitu media yang digunakan untuk kultur
pertumbuhan sel tumbuhan atau binatang dan jenis yang kedua yaitu kultur
mikrobiologi yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme seperti bakteri
dan jamur (Madigan, 2005).
Media
kultur harus dalam keadaan steril yang mana nantinya berfungsi untuk memberikan
hasil kultur yang murni. Kontaminasi dalam mikrobiologi adalah proses tercemarnya suatu kultur murni
dengan mikroba lain karena ketidak aseptisan langakah yang diambil oleh
praktikan.
Sterilisasi dalam mikrobiologi berarti membebaskan tiap
benda atau substansi dari semua kehidupan dalam bentuk apapun. Untuk tujuan
mikrobiologi dalam usaha mendapatkan keadaan steril, mikroorganisme dapat
dimatikan setempat oleh panas (kalor), gas-gas seperti formaldehid, etiloksida,
atau betapriolakton oleh bermacam-macam larutan kimia oleh sinar lembayung
ultra atau sinar gama. Mikroorganisme juga dapat disingkirkan secara mekanik
oleh sentrifugasi kecepatan tinggi atau oleh filtrasi (Curtis, 1999).
Sterilisasi dengan udara kering menggunakan alat yang
umum dikenal sebgai oven. Alat ini dipakai untuk menstrilkan alat-alat gelas
seperti Erlenmeyer, cawan petri, tabung reaksi dan alat gelas lainnya,
bahan-bahan seperti kapas, kain, dan kertas dapat disterilkan dengan alat ini.
Pada umumnya suhu yang digunakan pada sterilisasi secara kering adalah 110-180⁰C selama paling sedikit 2
jam. Lama sterilisasi tergantung pada alat dan jumlahnya (Machmud, 2008).
Sterilisasi
dengan uap panas, bahan yang mengandung cairan tidak dapat disterilkan dengan
oven sehingga digunakan alat ini. Alat ini disebut Arnold steam sterilizer
dengan suhu 100 derajat C dalam keadaan lembab. Secara sederhana dpat pula
digunakan dandang. Mula-mula bahan disterilkan pada suhu 100 derajat C selama
30 menit untuk membunuh sel-sel vegetative mikroba. Kemudian disimpan pada suhu
kamar selama 24 jam untuk memberi kesempatan spora tumbuh menjadi sel
vegetative, lalu dipanaskan lagi 100 derajat C 30 menit, dan diinkubasi lagi 24
jam dan disterilkan lagi, jadi ada 3 kali sterilisasi. Banyak bakteri berspora
belum mati dengan cara ini sehingga dikembangkan cara berikutnya yaitu uap air
bertekanan (Machmud, 2008).
Sterilisasi dengan uap
panas bertekanan, alat ini disebuT autoklaf untuk sterilisasi ini alat
dilengkapi dengan katup pengaman. Alat diisi dengan air kemudian bahan
dimasukkan. Panaskan sampai mendidih dan dari katup pengaman keluar uap air
dengan lancer lalu ditutup. Suhu akan naik sampai 121 derajat C dan biarkan
sampai 15 menit, lalu biarkan dingin sampai tekanan normal dan klep pengaman
dibuka, cara ini akan mematikan spora dengan cara penetrasi panas ke dalam sel
atau spora sehingga lebih cepat. Untuk bahan yang tidak tahan panas maka cara
diatas tidak dapat dipakai (Machmud, 2008).
Sinar UV juga bisa
digunakan untuk mensterilkan alat laboratorium, tapi penggunaannya lebih kepada
alat besar seperti lemari dan ruangan karena kita tidak mungkin mencuci semua
alat ini dan dengan sinar UV bisa lebih cepat menyelesaikan sterilisasinya. Sinar UV banyak digunakan
sebagai media sterilisasi,karena kemampuan radiasi sinarnya mampu membunuh
bakteri dan kuman terutama sinar UV dengan panjang gelombang 2540 Ã… mempunyai
daya bunuh yang sangat efektif dibanding dengan sinar ultraviolet dengan
panjang gelombang yang lebih panjang atau lebih pendek.sinar UV membunuh
bakteri berdasarkan luas ruangan yang disteril dan jenis bakteri/kuman.
1.2
Tujuan Praktikum
Mahasiswa
dapat membuat berbagai macam media dan mengerjakan sterilisasi alat.
BAB II
ALAT DAN BAHAN
2.1 Alat
- Autoclave
- Botol
- Cawan Petri
- Detergen
- Erlenmeyer
- Gelas Ukur
- Kain saring
- Kapas
- Kertas Alumunium Foil
- Kompor
- Lap
- Neraca Analitik
- Oven
- Panic
- Spatula
- Tabung Reaksi
2.2 Bahan
- Aquades
- Larutan Buffer Fosfat (NaCl)
- Medium Eosin Methylene Blue (EMB)
- Medium Nutrient Agar (NA)
- Meduim Plate Count Agar (PCA)
- Medium Potato Dextrose Agar (PDA)
BAB III
PROSEDUR
Praktikum
Mikrobiologi pada pertemuan sebelumnya bernama Pembuatan Medium dan Sterilisasi.
Pada praktikum tersebut, ada beberapa prosedur percobaan yang harus
diperhatikan. Berikut penjelasannya.
A.
Pembuatan Medium
1.
Medium instan yang diperlukan (NaCl, NA, NB, PDA,
PCA, SSA, LB) disiapkan.
- Massa medium yang
diperlukan
dihitung, berdasarkan yang terterapada label medium
instan dan dihitung menggunakan rumus yang
diberikan oleh asisten.
- Medium instan ditimbang menggunakan neraca analitik.
- Medium dilarutkan dengan aquades dengan volume
sesuai perhitungan,
dalam labu Erlenmeyer.
- Labu Erlenmeyer
disumbat dengan kapas dan kain kasa, lalu tutup dengan almunium foil.
- Medium dipanaskan diatas panci yang berisi
air mendidih yang dasarnya telah dialasi dengan lap. (Semua medium dipanaskan kecuali NaCl dan LB).
B. Pembuatan
Larutan Pengenceran
1.
Serbuk
NaCl Fis ditimbang sampai mencapai berat 0,85 gram.
2.
Setelah
itu, dilarutkan dalam 100 mL aquades.
3.
Terakhir,
hitung pencampuran NaCl Fis dengan aquades sampai mendapat hasil 0,85 %
C. Sterilisasi Basah
Sterilisasi ini
dilakukan dengan dua cara, yaitu secara direbus dan penggunaan autoklaf.
Pertama – tama akan dijelaskan sterilisasi pada autoklaf.
1.
Autoklaf diisi dengan akuades, jangan sampai melebihi penyangga tempat penyimpanan alat/media.
2.
Tempat penyimpanan alat/media disimpan.
3.
Alat/bahan/medium yang akan disterilkan dimasukkan kedalam
autoklaf.
4.
Autoklaf ditutup dengan rapat dan kunci pada tutup dikencangkan.
5.
Tombol
ON yang menempel di dinding tembok
dinyalakan (sampai lampu menyala). Kemudian tombol ON pada autoklaf dinyalakan (posisi tombol keatas), atur suhu pemanasan dengan cara memutarkan tombol (sebelah tombol power) ke 1,2,3,…,7. Semakin tinggi angka yang dipilih, semakin tinggi suhu yang akan diberikan.
6.
Klep pengaman, yaitu tempat uap air keluar berfungsi menjaga stabilitas tekanan tetap terbuka.
7.
Setelah air dari klep menetes, klep tersebut ditutup.
8.
Setelah klep tertutup, jarum penunjuk suhu dan tekanan akan bergerak menunjuk angka yang lebih besar karena suhu dan tekanan autoklaf naik.
9.
Bila jarum sudah menunjukkan angka 121oC/15 lbs, kedudukan selama waktu sterilisasi yang diperlukan harus dijaga dengan cara mengukur besar kecilnya pemanasan.
- Setelah sterilisasi selesai dilakukan, listrik/api dimatikan tapi jarum penunjuk dibiarkan kembali ke nol dengan sendirinya (jangan dipaksakan ).
- Setelah jarum penunjuk kembali ke nol, klep dibuka dan tutup digeser lalu isi autoklaf dapat dikeluarkan.
- Setelah selesai, tombol POWER dimatikan.
Cara kedua
dengan perebusan akan dijelaskan sebagai berikut
1.
Didihkan
air pada panci
2.
Masukkan
alat – alat yang telah dipersiapkan dan tunggu beberapa saat
3.
Setelah selesai
alat – alat diagkat dan dimasukkan ke dalam lemari penyimpnan.
D. Sterilisasi Kering
1. Alat-alat (botol, cawan
Petri, labu Erlenmeyer, dll) dicuci dengan deterjen
lalu dibilas sampai bersih, dikeringkan, dan dibungkus.
2. Alat-alat tersebut dimasukan kedalam oven, suhu oven diatur 170-180oC.
3. Oven dipanaskan selama 2 jam. Kemudian alat-alat yang sudah steril dimasukan kedalam lemari steril, sedangkan botol steril siap digunakan untuk kemasan produk.
4. Tutup botol yang terbuat dari plastic cukup dicuci bersih kemudian dibilas air panas.
BAB
IV
HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Pengamatan
Tabel 1. Hasil
Pengamatan Medium (Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2016)
Jenis Media
|
Bubuk
|
|
Larutan
|
|
Fungsi
|
Komposisi
|
|
Warna
|
Aroma
|
Warna
|
Aroma
|
Setelah Sterilisasi
|
|
|
NA
|
Kuning
|
Biasa
|
Kuning Bening
|
Menyengat
|
Kuning sedikit pekat
|
Pertumbuhan mayoritas mikroorganisme heterotfof
|
5 g/L pepton daging; 3 g/L ekstrak daging; 12 g/L agar
|
PDA
|
Putih Tulang
|
Biasa
|
Kuning Lemon
|
Menyengat
|
Kuning sedikit pekat
|
Menumbuhkan dan mengidentifikasi kapang dan khamir
|
4g/L ekstrak kentang;20g/L Dekstrosa;15g/L Agar
|
PCA
|
Krem
|
Menyengat
|
Kuning
|
Sangat Menyengat
|
Putih
|
|
5g/L tripton;2,8g/L ekstrak yeast;1g/L glukosa;9g/L agar
|
EMB
|
Ungu
|
Biasa
|
Merah Keunguan
|
Menyengat
|
Merah Keunguan
|
Mendeteksi adanya bakteri E.
coli
|
Pepton;Laktosa;Hidrogen;Dipotasium Phospat;Eosiny;Methilen Blue;
Agar
|
NaCl Fisiologis
|
Putih
|
Garam
|
Bening
|
-
|
Bening
|
Sebagai pengencer serta antibiotik
|
Sodium Klorida
|
4.2. Pembahasan
4.2.1. Media
Semua
makhluk hidup di dunia sudah pasti memerlukan tempat untuk tumbuh dan
berkembang sesuai dengan habitat serta keberadaan makanan. Hal ini berlaku juga
untuk mikroorganisme. Saat seseorang akan menumbuhkan mikroorganisme, hal yang
harus dilakukan adalah menyiapkan tempat tumbuh serta nutrisi yang dibutuhkan
mikroorganisme yang akan dibiakkan yaitu substrat yang kemudian disebut
media/medium. Media berguna untuk membantu menumbuhkan mikroba, mengisolasi,
memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi, serta melakukan perhitungan
jumlah mikroba (Adityawarman, 2011). Media kultur dapat berbentuk cair, semi
padat, dan padat (Afrianto, 2008).
Agar
merupakan ekstrak rumput laut dengan kandungan karbohidrat yang didominasi oleh
galaktosa dan tidak mengandung nutrisi. Media padat setidaknya membutuhkan 1.5%
hingga 1.8% agar. Sedangkan media semi padat hanya membutuhkan kurang dari 1%
agar. Media yang berwujud cair tidak mengandung agar sebagai pengental dan
biasa disebut dengan medium kaldu (broth
medium). Penambahan agar akan membuat medium berbentuk semi padat atau
padat. Agar adalah agen pengental yang baik. Agar dapat mencair pada suhu 100°C
dan mengental pada suhu 40°C. Apabila akan
dilakukan kultur, lebih baik dilakukan dalam suhu 37.5°C atau sedikit lebih tinggi sehingga medium tidak
mencair (Afrianto, 2008).
Media
juga dibagi menjadi media umum dan media khusus. Media umum adalah media yang
ditambahkan bahan-bahan stimulan pertumbuhan mikroba secara umum seperti
karbohidrat, glukosa dan sejenisnya, serta nutrien lainnya. Media khusus dapat
membantu mengisolasi dan mengidentifikasi mikroba spesifik. Untuk tujuan
khusus, media dibagi menjadi 4, yaitu media selektif, media diferensia, media enrichment, dan media kombinasi selektif
dan diferensial (Afrianto, 2008). Media selektif dibuat dengan penambahan
senyawa kimia yang dapat menghambat satu kelompok mikroba yang lain namun
memacu pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Sedangkan media diferensia
mengandung bahan tambahan yang dapat menyebabkan perubahan warna media apabila
terjadi reaksi kimia tertentu. Media tersebut digunakan untuk membedakan
bakteri berdasarkan karakteristik biokimianya. Media enrichment atau diperkaya adalah media yang mengandung aditif yang
menghambat pertumbuhan dan membantu meningkatkan pertumbuhan mikrooganisme
tertentu yang jumlahnya sedikit dalam suatu campuran. Media ini hampir mirip
dengan media selektif, perbedaannya terletak pada jenis zat kimia yang
ditambahkan pada media. Kombinasi media selektif dan diferensia memungkinkan
menghambat pertumbuhan mikroba satu dengan pertumbuhan lainnya (Afrianto,
2008).
Dalam
praktikum ini, dilakukan pembuatan beberapa medium yaitu Nutrient Agar (NA), Potato
Dextrose Agar (PDA), Plate Count Agar
(PCA), Eosin Methylene Blue
(EMB), dan pengencer NaCl Fisiologis.
4.2.1.1. Nutrient Agar (NA)
Nutrient
Agar (NA) adalah medium umum untuk uji air dan produk diary. NA banyak digunakan untuk
pertumbuhan mayoritas mikroorganisme yang tidak selektif atau disebut juga
mikroorganisme heterotrof. NA matriks mengandung pepton 15.0 g/L, ekstrak ragi 3.0
g/L, sodium klorida 6.0 g/L, dekstrosa 1.0 g/L, dan agar 12.0 g/L.Ekstrak ragi
berguna untuk sumber karbohidrat bagi mikroorganisme. Agar berfungsi sebagai
pemadat medium serta aquades sebagai pelarutnya. Adanya pepton pada NA sangat
baik untuk mikroba untuk cepat tumbuh karena mengandung banyak unsur Nitrogen
(Dwidjooseputro, 1994). NA juga dapat digunakan untuk mengulturasi Enterobacteriacease, Pseudomonas spp, Staphylococcus spp, dan
Streptococcus spp (Niedersterbruch, 2013).
Selain itu, media umum ini digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji
biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa stok kultur, pertumbuhan
sampe pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni.
Pada
botol NA, tertera bahwa penggunaan sebanyak 20 gram untuk satu liter. Sehingga,
dalam penggunaan volume tertentu (praktikum ini memerlukan 20 ml NA) dengan rumus pengenceran m1V1 =m2V2 diperlukan 0.4 gram bubuk agar NA.
Rumus
yang digunakan adalah rumus umum pengenceran dan digunakan dalam pengenceran
media manapun. Dengan perhitungan tersebut, disiapkan 0,4 gram bubuk NA yang
diukur dengan neraca analitik menggunakan beaker
glass. Kemudian diencerkan dengan aquades pada erlenmeyer hingga volume
menjadi 20 ml. Setelah itu, erlenmeyer ditutup sumbat cotton lalu ditutup kembali dengan alumunium voil untuk menjaga uap air tidak masuk karena autoclave termasuk sterilisasi basah.
4.2.1.2. Potato Dextrose Agar (PDA)
Potato
Dextrose Agar adalah media komplek dan media
diferensial untuk pertumbuhan jamur dan ragi sehingga sering digunakan sebagai
uji untuk menentukan jumlah jamur dan ragi dengan menumbuhkan mikroba pada
permukaan media yang kemudian terbentuk koloni yang dapat diikat dan dihitung
(Fardiaz, 1992). PDA mengandung 1.5% agar, 2% dekstrosa, serta nitrogen,
fosfor, citamin, dan mikronutrien dari ekstrak kentang yang kemudian dapat
disimpulakan 0,4% ekstrak kentang (Griffith, 2007). Dekstrosa pada PDA berguna
sebagai sumber karbon, sedangkan ekstrak kentang tersebut memenuhi sebagian
besar makro dan mikronutrien yang dibutuhkan mikroorganisme. (Rizaki, 2015).
Dengan adanya sumber karbohidrat dan glukosa serta makro dan mikronutrien yang
umum terdapat pada tanah, PDA dijadikan medium isolasi dan identifikasi pada
mikrofungi berupa kapang dan khamir dan tidak baik untuk bakteri sehingga dapat
digolongkan sebagai media khusus diferensial. Seperti yang tertera pada botol
(39 gram untuk 1 liter), menurut perhitungan dasar pengenceran, diperlukan 0.78 gram bubuk PDA untuk 20 ml aquades.
Resep
pembuatan PDA adalah dari 100 gram kentang segar yang dikupas, lalu diiris dan
dihomogenkan dengan 300 ml air kran, diblender, kemudian didiamkan semalam
dengan suhu 41°C, sebelum difiltrasi dengan muslin. Dengan total 230 ml ekstrak
kentang, 20 gram glukosa, 15 gram agar dicampurkan sebelum mencapai 1 liter.
Kemudian disterilisasi dengan autoclave
dalam 121°C selama 15 menit sebelum diaplikasikan ke cawan petri. Dalam
beberapa kasus, air destilasi digunakan untuk mencegah kontaminasi dari
berbagai macam logam yang ada pada air kran. (Griffith, 2007).
4.2.1.3. Plate Count Agar (PCA)
PCA digunakan sebagai medium bagi
mikroba dengan inokulasi diatas permukaan. PCA merupakan media padat yang baik
bagi pertumbuhan hampir semua jenis mikroba karena mengandung komposisi casein enzymichydrolisate yang
menyediakan amino dan substansi nitrogen kompleks lainnya serta ekstrak yeast demi suplai vitamin B kompleks.
Seperti yang tertera pada botol PCA, PCA mengandung tripton 5.0 g/L, ekstrak yeast 2.8g/L, glukosa 1.0g/L, serta agar
9.0g/L. Selain itu, perhitungan pengenceran PCA dengan petunjuk pada botol
(1,75 gram untuk 1 liter) sehingga dibutuhkan 0.35 gram untuk 20 ml aquades.
4.2.1.4. Eosin Methylene Blue (EMB)
Media Eosin Methylene Blue mempunyai
keistimewaan karena mengandung laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang
memfermentasi laktosa seperto E. Coli
dengan mikroba yang tidak memfermentasikan laktosa seperti S. aureus, P. aeruginosa,
dan Salmonella. Mikroba yang
memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan
kilap logam, sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna.
Adanya eosin dan methylene blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun, jika
media ini digunakan pada tahap awal, karena mikroba lain juga tumbuh terutama P. aeruginosa dan Salmonella sp, dapat menimbulkan keraguan. Bagaimanapun media Eosin Methylene Blue sangat baik untuk
mengonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E. Coli (Afrianto, 2008).
Seperti yang tertera pada botol, Eosin Methylene Blue mengandung pepton,
laktosa, hidrogen, dipotasium fosfat, eosiny, methylene blue, serta agar sehingga EMB termasuk media padat. Dalam
petunjuk penggunaannya, tertera 500 gram untuk 13.300 liter, sehingga dibutuhkan 0.7 gram bubuk EMB untuk dilarutkan dengan 20ml aquades.
4.2.1.5. Physiological Natrium Chloride (NaCl
Fisiologis)
NaCl
digunakan sebagai larutan pengencer agar suspensi sampe tetap steril dan
menghindari adanya kontaminan pada sampel. Selain itu, NaCl Fisiologis yang
memiliki kandungan sodium klorida juga dapat mempertahankan kondisi pH.Prinsip
pengenceran adalah menurunkan jumlah mikroba sehingga semakin banyak jumlah
pengencer, semakin sedikit jumlah mikroba yang didapat. Dalam beberapa kasus,
dapat terjadi hanya ada satu mikroba dalam satu tabung (Waluyo, 2004). NaCl
Fisiologis (umumnya 0.9% - 1.2%) merupakan larutan elektolit garam yang umumnya
memiliki mol sangat kecil (± 0.2%) dan kandungan klorida yang justru membantu
mikroba untuk menyeimbangkan elektrolit sel dengan lingkungan sehingga mencegah
sel mikroba mengalami lisis.
Pada
botol NaCl-Fis, tertera petunjuk penggunaan yaitu 0.85 gram untuk 100 ml.
Sehingga, diperoleh perhitungan membutuhkan 0.17 gram bubuk NaCl fisiologis untuk 20 ml aquades.
4.2.2.
Sterilisasi
Sterilisasi adalah proses menghilangkan
mikroba, spora, dan kontaminan lainnya dengan cara pemanasan. Semua material
sebagai subjek proses ini disebut bahan steril. Terdapat dua pengertian
mengenai steril, yaitu steril mutlak dan steril komersial. Steril mutlak adalah
kondisi steril saat benar-benar tidak ada kehidupan dalam benda tersebut.
Steril mutlak umumnya diaplikasikan pada alat laboratorium, kemasan bahan
pangan, dan lainnya. Bila steril mutlak dilakukan terhadap bahan pangan,
kerusakan komponen bahan pangan dapat terjadi dan hal tersebut tentunya tidak
diinginkan. Steril komersial yang umumnya dilakukan terhadap bahan pangan ini
bermaksud untuk mematikan mikroorganisme pathogen beserta sporanya tanpa
merusak komponen bahan pangan.
Terdapat
macam-macam teknik sterilisasi yang dapat dilakukan dalam laboratorium
mikrobiologi yaitu:
4.2.2.1.
Pemanasan dengan Api
Pemijaran
dapat langsung membunuh mikroorganisme. Umumnya, pemijaran termasuk sterilisasi
mutlak karena berlaku untuk alat-alat laboatorium saja seperti ose, jarum
inokulum atau spreader, dan lain
sebagainya. Dalam laboratorium, sumber api yang digunakan adalah bunsen burner, pembakar spirtus, atau loop
incinerator berupa tabung keramik panas hingga 815°C dan hanya membutuhkan
6 detik untuk sterilisasi.
4.2.2.2.
Pemanasan Kering
Mikroorganisme
dapat mengalami kekeringan bila dipanaskan pada suhu tinggi sehingga sel akan
lisis. Jika sterilisasi ini tidak maksimal (kurang panas), kemungkinan masih
adanya endospora lebih besar. Pemanasan kering menggunakan oven. Oven mampu
menjaga suhu pada 160°C hingga 170°C. Umumnya, alat yang disterilkan menggunakan
oven adalah alat gelas seperti cawan atau pipet ikur dan bukan alat berbahan
plastik atau karet. Sterilisasi dilakukan pada suhu tersebut hingga 1-2 jam
atau 180°C selama 30 menit dengan 1 jam waktu pendinginan. Oven yang baik
memiliki termometer atau alat perekam temperatur dan dilengkapi indikator waktu
dan pemrograman waktu. Setelah sterilisasi, usahakan untuk tidak segera
mendinginkannya diluar untuk mencegah keretakan gelas, atau harus didiamkan
dahulu di dalam oven beberapa waktu.
4.2.2.3.
Uap Air Panas
Cara
ini menggunakan prinsip yang berbeda dengan pemanasan lainnya. Uap air panas
mampu membunuh mikroorganisme dengan menonaktifkan enzim-enzimnya sehingga
metabolisme berhenti bekerja. Alat yang digunakan dalam sterilisasi ini adalah steamers dan water
bath. Keduanya memiliki prinsip teknik sama yaitu sebuah wadah yang
menampung air dengan elemen pemanas dan bertutup. Uap air yang dihasilkan
berada pada tekanan atmosfer. Water bath
mampu memanaskan air hingga atau hampir mendekati titik didih dengan atau tanpa
menghasilkan uap air. Hal yang perlu diperhatikan adalah penjagaan batas air
minimal sesuai manual sehingga menutupi elemen pemanas. Pencairan kembali media
agar steril dapat dilakukan pada water
bath dengan suhu 47°C hingga 50°C. Media harus diangkat segera setelah
semua mencair dan digunakan tidak melebihi waktu simpan 4 jam. Steaming yang dikembangkan John Tyndall
juga merupakan cara sterilisasi uap air panas yang dapat mencapai suhu 100°C
pada wadah tanpa tekanan. Sterilisasi ini dapat dilakukan sekali atau tiga kali
(tahap) dengan hari yang berbeda dengan memanaskannya pada suhu 80°C selama
satu jam (Barrow dan Feltham, 1993). Sedangkan, tindalisasi dilakukan pada suhu
90-100°C selama 30 menit secara bertahap
tiga kali. Selama jeda, tahapan media diinkubasi pada 37°C semalam. Pemanasan
tiga tahap dimaksudkan untuk memberi kesempatan endospora untuk berkembang
sehingga akan mati pada tahap pemanasan selanjutnya (Hogg, 2005).
4.2.2.4. Uap Air Panas
Bertekanan
Uap air panas
bertekanan lebih efisien dan penetratif dalam membunuh mikroorganisme. Tekanan
yang paling efisien yaitu 103 kPa (15 Psi) selama 15 menit yang dapat dilakukan
dengan autoklaf. Menurut Morello (2003), tekanan yang digunakan untuk
sterilisasi pada umumnya 15 Psi atau 1 atm dengan suhu 121°C . Sehingga, tekanan yang bekerja ke
seluruh permukaan benda mencapai 15 pon tiap inchi². Autoklaf menggunakan uap
air murni yang lebih ringan dan panas daripada udara untuk sterilisasi sehingga
udara yang terdapat dalam wadah harus dikeluarkan. Pada saat sumber panas
dinyalakan, air dalam autoklaf akan mendidih dan uap air terbentuk lalu
mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara dalam autoklaf
diganti dengan uap air, katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf
naik. Saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai, proses sterilisasi dimulai
dan timer mulai menghitung waktu
mundur. Setelah sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan
dibiarkan turun perlahan hingga sama dengan atmosfer. Autoklaf tidak boleh
dibuka sebelum tekanan turun hingga nol. Hal yang sering terjadi adalah dengan
menutup semua katup rapat-rapat sebelum udara dalam wadah tergantikan oleh uap
air, ini adalah perbuatan yang salah. Adanya udara dalam wadah saat sterilisasi
dapat mengakibatkan kurang efisiennya sterilisasi sehingga autoklaf hanya
mencapai suhu maksimal pada kondisi uap air murni saja.
Autoklaf
juga digunakan untuk dekontaminasi. Dekontaminasi adalah sterilisasi terhadap
semua biakkan hasil analisis atau yang telah tumbuh pada media. Dalam proses
sterilisasi diperpanjang waktunya menjadi minimal 30 menit pada 121°C atau
10 menit pada 126°C .
4.2.2.5.
Penyinaran/Radiasi
Salah
satunya adalah radiasi non-ionisasi seperti sinar UV. Sinar UV dapat digunakan
secara fisik yaitu dengan memaparkan alat atau bahan kepada sinar UV dengan
waktu tertentu. Panjang gelombang yang umum dipakai adalah 260 nm karena
panjang gelombang ini mampu merusak komponen asam nukleat berupa purin dan
pirimidin dan asam amino aromatik pada protein. Energi yang diabsorbasi merusak
ikatan kimia komponen tersebut sehingga tidak berfungsi secara normal.
Penetrasi sinar UV sangat lemah, selembar kertas atau lapisan tipis kaca dapat
menghalanginya sehingga aplikasi praktisnya adalah mensterilisasi permukaan
meja kerja atau untuk air pada pengolahan air. Radiasi menggunakan sinar gamma
yaitu radiasi ionisasi. Sinar gamma memiliki panjang gelombang yang lebih
pendek dengan energi yang lebih besar sehingga memberi kekuatan penetrasi yang
baik. Efek dari radiasi ionisasi adalah terbentuknya radikal bebas yang sangat
reaktif sehingga merusak struktur makromolekul seperti DNA dan protein.
4.2.2.6.
Sterilisasi Kimia
Sterilisasi
juga dapat dilakukan dengan menambahkan zat kimia antibakteri pada bahan atau
alat. Umumnya jenis zat kimia yang digunakan adalah alkohol atau ethanol
sebagai disinfektan dengan konsentrasi dibawah 100%. Konsentrasi yang sering
digunakan untuk disinfektan adalah 70%. Selain mendenaturasi protein, alkohol
dapat melarutkan lemak sehingga berpengaruh terhadap membran sel dan kapsul
beberapa jenis virus. Sel vegetatif dan hifa dapat dimatikan dengan alkohol,
namun spora kadang resisten. Alkohol digunakan sebagai pelarut disinfektan lain
seperti iodin yang dapat meningkatkan efektivitas disinfeksinya.
Selain alkohol,
halogen atau klorin juga efektif sebagai disinfeksi dalam bentuk gas bebas dan
sebagai senyawa pelepas klorin seperti klotir dan kloramin. Senyawa yang lebih
stabil lainnya yaitu kloramin yang memiliki keunggulan lebih tahan terhadap
bahan organik sehingga lebih tidak beracun dan mampu melepas klorin secara
perlahan sehingga memperpanjang efek bakterisidal disinfektan ini. Jenis
halogen lainnnya adalah iodin dengan daya kerja bereaksi dengan residu tirosin
pada protein. Selain itu, ada juga senyawa fenol dengan gugus asam karboksilat
yang memiliki daya kerja merusak protein dan membran sehingga fenol dapat tetap
aktif walaupun terdapat senyawa organik dan detergen.
BAB
V
KESIMPULAN
DAN SARAN
5.1. Kesimpulan
1. Media
berguna untuk membantu menumbuhkan mikroba, mengisolasi, memperbanyak jumlah,
menguji sifat-sifat fisiologi, serta melakukan perhitungan jumlah mikroba.
2. Media
kultur dapat berbentuk cair, semi padat, dan padat berdasarkan komposisi
agarnya.
3. Media
umum adalah media yang ditambahkan bahan-bahan stimulan pertumbuhan mikroba
secara umum.
4. Media
khusus dapat membantu mengisolasi dan mengidentifikasi mikroba spesifik.
5. Media
NA padat banyak digunakan untuk pertumbuhan mayoritas mikroorganisme yang tidak
selektif atau disebut juga mikroorganisme heterotrof.
6. Potato Dextrose Agar adalah
media kompleks dan media diferensial untuk pertumbuhan jamur dan ragi sehingga
sering digunakan sebagai uji untuk menentukan jumlah jamur dan ragi.
7. PCA
merupakan media umum padat yang baik bagi pertumbuhan hampir semua jenis
mikroba.
8. Media
Eosin Methylene Blue mengandung
laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasi laktosa seperti E. Coli.
9. NaCl
Fisiologis merupakan larutan elektrolit garam dengan kandungan klorida yang membantu
mikroba menyeimbangkan elektrolit sel dengan lingkungan sehingga mencegah lisis
sel.
10. Sterilisasi
adalah proses menghilangkan mikroba, spora, dan kontaminan lainnya dengan cara
pemanasan.
11.
Steril mutlak adalah kondisi steril saat
benar-benar tidak ada kehidupan dalam benda tersebut. Steril komersial
bertujuan mematikan mikroorganisme pathogen beserta sporanya tanpa merusak
komponen bahan pangan.
12. Sterilisasi
dapat dilakukan dengan pemanasan pijar api, pemanasan kering, pemanasan uap air
panas, pemanasan uap air panas bertekanan, penyinaran/radiasi, dan sterilisasi kimia
5.2.
Saran
1.
Praktikan terlebih dahulu sudah memahami
cara sterilisasi dan berbagai macam medium yang akan digunakan.
2.
Alat dan daerah kerja harus dalam
keadaan bersih (meskipun tidak steril) sehingga pengerjaan lebih efisien.
3.
Alat pengukuran yang digunakan harus
dipersiapkan agar tidak menimbulkan keraguan dalam perhitungan dan pengenceran.
4.
Praktikan terlebih dahulu memahami
teknik penggunaan autoklaf sehingga sterilisasi menjadi optimal.
DAFTAR
PUSTAKA
Adityawarman, A. C. 2011. Teknik Pengolahan Daging. Terdapat pada: http://www.academia.edu (diakses pada tanggal 26 Maret 2016 pukul
16.39 WIB)
Afrianto,
Eddy. 2008. Pengawasan Mutu Bahan/Produk
Pangan Jilid 2 untuk SMK.
Direktorat Pembinaan Sekolah Menengah Kejuruan, Jakarta.
Barrow,
GI dan RKA Feltham. 1993. Cowan and Steel’s, Manual for The Identification of Medical Bacteria. Cambridge
University Press, New York
Dwidjoseputro,
D. 1994.
Dasar-Dasar Mikrobiologi.
Djambatan, Jakarta.
Fardiaz,
S. 1989. Mikrobiologi Pangan 1.
Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi. Fateta
IPB, Bogor.
Griffith,
Garth W. 2007. Copper deficiency in potato dextrose agar causes reduced pigmentation in cultures of various
fungi. FEMS Microbiology Letters : 276 : 165-171.
Hogg,
Stuart. 2005. Essential Microbiology.
John Wiley and Sons, Chicester.
J.
Pelczar, Micheal. 1988. Dasar-Dasar
Mikrobiologi. UI Press: Jakarta.
Morello,
JA, PA Granato, HE Mizer. 2003. Laboratory Manual and Workbook in Microbiology, Application to
Patient Care. 7: Mc Graw Hill Companies. (tempat
tidak diketahui)
Niederstebruch,
N. dan Sixt, D. 2013. Standard Nutrient Agar 1 as a substitute for blood-supplemented Müller–Hinton agar
for antibiograms in developing countries.
European Journal Of Clinical
Microbiology & Infectious Disease
: 21 : 237-241.
Pratiwi
T., Sylvia. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Penerbit Erlangga, Jakarta
Rovná,
KatarÃna; Bakay, Ladislav; Petrová, Jana; Terentjeva, Margarita; Cerná, JanaView Profile; et al. 2015.
Characterization of endophytic microflora of
Rosa canina fruits. The Journal of Microbiology, Biotechnology
and Food Sciences : 4: 65-68.
Waluyo,
L. 2004. Mikrobiologi Umum. UMM
Press, Malang.
LAMPIRAN
JAWABAN
DAN PERTANYAAN
1. Setelah saudara pelajari dan dipraktekkan, jelaskan fungsi penambahan beef
extract pada pembuatan media NA dan fungsi penambahan kentang pada pembuatan media PDA! Mengapa berbeda?
Fungsi penambahan beef
extract pada pembuatan media NA
adalah untuk menambahkan nutrisi untuk pertumbuhan bakteri seperti protein dan
beberapa vitamin kompleks lainnya. Penambahan kentang berfungsi sebagai sumber karbohidrat dalam jumlah cukup sehingga baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir tetapi kurang baik untuk pertumbuhan bakteri karena terdapat senyawa yang bersifat asam pada kentang yang sangat
sensitif untuk kentang. NA lebih dominan untuk pertumbuhan bakteri sedangkan PDA untuk pertumbuhan kapang dan khamir.
2. Jelaskan fungsi dari larutan pengencer? Mengapa harus menggunakan KH2PO4? Dapatkah digantikan senyawa kimia lain?
Fungsi dari larutan pengenceran adalah menurunkan jumlah mikroba sehingga semakin banyak jumlah pengenceran yang dilakukan, makin sedikit jumlah mikroba. Jumlah mikroba terbaik untuk dapat dihitung yaitu antara 30 sampai 300 sel mikroba per ml. Larutan pengencer harus menggunakan KH2PO4 karena kalium dan fosfatnya berguna untuk member nutrisi sel mikroorganisme. Larutan pengencer dapat diganti air sadah yang umumnya mengandung ion kalsium dan magnesium yang tinggi.