Laporan Praktikum Media Mikrobiologi

LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI PANGAN

Kelompok 2

            Parlindungan Teguh Steven                                        240210150074

Hayu Lesya Putri                                                        240210150075

Violita Widyaningtyas                                                240210150076

Bayu Airlangga                                                           240210150077

Indah Medani K.A.P                                                  240210150078

Adira Dwi Rahmi                                                       240210150079

UNIVERSITAS PADJADJARAN

FAKULTAS TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN

DEPARTEMEN TEKNOLOGI INDUSTRI PANGAN

JATINANGOR

2016

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Teori Dasar

                Media kultur bakteri adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi atau zat-zat hara (nutrisi) yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di atas atau di dalamnya. Selain itu, media kultur mikroba dapat dipergunakan pula untuk isolasi, perbanyakan, pengujuan sifat-sifat fisiologis, dan perhitungan jumlah mikroorganisme (Sumarsih, 2003).

            Media kultur yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme ada dalam bentuk padat, semi padat, dan cair. Media kultur padat diperoleh dengan menambahkan  agar-agar. Agar-agar berasal dari ekstrak ganggang merah. Kandungan galaktan pada agar-agar sebagai zat pemadat adalah 1,5%-2,0% dan membeku pada suhu 45⁰C. Agar-agar sulit diurai oleh bakteri (Utami, 2004).

            Untuk media kultur semi-padat dan cair ada perbedaan dalam penggunaan pemadat dalam unsur medianya. Di media kultur semi padat zat pemadat seperti agar hanya dalam komposisi yang kecil sehingga pemadatan hanya akan terjadi sedikit atau sebagian. Adanya bagian yang tidak memadat atau tetap dalam keadaan cair juga bertujuan untuk ditujukan kepada beberapa jenis mikroba.

            Untuk media kultur cair, penggunaan zat pemadat tidak ada sama sekali. sehingga media memiliki kandungan air yang sangat banyak. Media ini juga ada karena ditujukan untuk mikroba yang hidup di air dan juga ditujukan pada kultur mikroalga.

                Media pertumbuhan bakteri atau media kultur bakteri adalah cairan atau gel yang di desain untuk mendukung pertumbuhan mikroorganisme dan sel. Terdapat dua  jenis utama media pertumbuhan yaitu media yang digunakan untuk kultur  pertumbuhan sel tumbuhan atau binatang dan jenis yang kedua yaitu kultur mikrobiologi yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme seperti bakteri dan  jamur (Madigan, 2005).

            Media kultur harus dalam keadaan steril yang mana nantinya berfungsi untuk memberikan hasil kultur yang murni. Kontaminasi dalam mikrobiologi  adalah proses tercemarnya suatu kultur murni dengan mikroba lain karena ketidak aseptisan langakah yang diambil oleh praktikan.

            Sterilisasi dalam mikrobiologi berarti membebaskan tiap benda atau substansi dari semua kehidupan dalam bentuk apapun. Untuk tujuan mikrobiologi dalam usaha mendapatkan keadaan steril, mikroorganisme dapat dimatikan setempat oleh panas (kalor), gas-gas seperti formaldehid, etiloksida, atau betapriolakton oleh bermacam-macam larutan kimia oleh sinar lembayung ultra atau sinar gama. Mikroorganisme juga dapat disingkirkan secara mekanik oleh sentrifugasi kecepatan tinggi atau oleh filtrasi (Curtis, 1999).

            Sterilisasi dengan udara kering menggunakan alat yang umum dikenal sebgai oven. Alat ini dipakai untuk menstrilkan alat-alat gelas seperti Erlenmeyer, cawan petri, tabung reaksi dan alat gelas lainnya, bahan-bahan seperti kapas, kain, dan kertas dapat disterilkan dengan alat ini. Pada umumnya suhu yang digunakan pada sterilisasi secara kering adalah 110-180⁰C selama paling sedikit 2 jam. Lama sterilisasi tergantung pada alat dan jumlahnya (Machmud, 2008).

Sterilisasi dengan uap panas, bahan yang mengandung cairan tidak dapat disterilkan dengan oven sehingga digunakan alat ini. Alat ini disebut Arnold steam sterilizer dengan suhu 100 derajat C dalam keadaan lembab. Secara sederhana dpat pula digunakan dandang. Mula-mula bahan disterilkan pada suhu 100 derajat C selama 30 menit untuk membunuh sel-sel vegetative mikroba. Kemudian disimpan pada suhu kamar selama 24 jam untuk memberi kesempatan spora tumbuh  menjadi sel vegetative, lalu dipanaskan lagi 100 derajat C 30 menit, dan diinkubasi lagi 24 jam dan disterilkan lagi, jadi ada 3 kali sterilisasi. Banyak bakteri berspora belum mati dengan cara ini sehingga dikembangkan cara berikutnya yaitu uap air bertekanan (Machmud, 2008).

Sterilisasi dengan uap panas bertekanan, alat ini disebuT autoklaf untuk sterilisasi ini alat dilengkapi dengan katup pengaman. Alat diisi dengan air kemudian bahan dimasukkan. Panaskan sampai mendidih dan dari katup pengaman keluar uap air dengan lancer lalu ditutup. Suhu akan naik sampai 121 derajat C dan biarkan sampai 15 menit, lalu biarkan dingin sampai tekanan normal dan klep pengaman dibuka, cara ini akan mematikan spora dengan cara penetrasi panas ke dalam sel atau spora sehingga lebih cepat. Untuk bahan yang tidak tahan panas maka cara diatas tidak dapat dipakai (Machmud, 2008).

Sinar UV juga bisa digunakan untuk mensterilkan alat laboratorium, tapi penggunaannya lebih kepada alat besar seperti lemari dan ruangan karena kita tidak mungkin mencuci semua alat ini dan dengan sinar UV bisa lebih cepat menyelesaikan sterilisasinya. Sinar UV banyak digunakan sebagai media sterilisasi,karena kemampuan radiasi sinarnya mampu membunuh bakteri dan kuman terutama sinar UV dengan panjang gelombang 2540 Å mempunyai daya bunuh yang sangat efektif dibanding dengan sinar ultraviolet dengan panjang gelombang yang lebih panjang atau lebih pendek.sinar UV membunuh bakteri berdasarkan luas ruangan yang disteril dan jenis bakteri/kuman.

1.2 Tujuan Praktikum

                Mahasiswa dapat membuat berbagai macam media dan mengerjakan sterilisasi alat.

BAB II

ALAT DAN BAHAN

2.1 Alat

• Autoclave
• Botol
• Cawan Petri
• Detergen
• Erlenmeyer
• Gelas Ukur
• Kain saring
• Kapas
• Kertas Alumunium Foil
• Kompor
• Lap
• Neraca Analitik
• Oven
• Panic
• Spatula
• Tabung Reaksi

2.2 Bahan

• Aquades
• Larutan Buffer Fosfat (NaCl)
• Medium  Eosin Methylene Blue (EMB)
• Medium Nutrient Agar (NA)
• Meduim Plate Count Agar (PCA)
• Medium Potato Dextrose Agar (PDA)

BAB III

PROSEDUR

            Praktikum Mikrobiologi pada pertemuan sebelumnya bernama Pembuatan Medium dan Sterilisasi. Pada praktikum tersebut, ada beberapa prosedur percobaan yang harus diperhatikan. Berikut penjelasannya.

A.            Pembuatan Medium

1.      Medium instan yang diperlukan (NaCl, NA, NB, PDA, PCA, SSA, LB) disiapkan.

2. Massa medium yang diperlukan dihitung, berdasarkan yang terterapada label medium instan dan dihitung menggunakan rumus yang diberikan oleh asisten.
3. Medium instan ditimbang menggunakan neraca analitik.
4. Medium dilarutkan dengan aquades dengan volume sesuai perhitungan, dalam labu Erlenmeyer.
5. Labu Erlenmeyer disumbat dengan kapas dan kain kasa, lalu tutup dengan almunium foil.
6. Medium dipanaskan diatas panci yang berisi air mendidih yang dasarnya telah dialasi dengan lap. (Semua medium dipanaskan kecuali NaCl dan LB).

B.        Pembuatan Larutan Pengenceran

1.      Serbuk NaCl Fis ditimbang sampai mencapai berat 0,85 gram.

2.      Setelah itu, dilarutkan dalam 100 mL aquades.

3.      Terakhir, hitung pencampuran NaCl Fis dengan aquades sampai mendapat hasil 0,85 %

C.        Sterilisasi Basah

            Sterilisasi ini dilakukan dengan dua cara, yaitu secara direbus dan penggunaan autoklaf. Pertama – tama akan dijelaskan sterilisasi pada autoklaf.

1.    Autoklaf diisi dengan akuades, jangan sampai melebihi penyangga tempat penyimpanan alat/media.

2.    Tempat penyimpanan alat/media disimpan.

3.    Alat/bahan/medium yang akan disterilkan dimasukkan kedalam

autoklaf.

4.    Autoklaf ditutup dengan rapat dan kunci pada tutup dikencangkan.

5.    Tombol ON yang menempel di dinding tembok dinyalakan (sampai lampu menyala). Kemudian tombol ON pada autoklaf dinyalakan (posisi tombol keatas), atur suhu pemanasan dengan cara memutarkan tombol (sebelah tombol power) ke 1,2,3,…,7. Semakin tinggi angka yang dipilih, semakin tinggi suhu yang akan diberikan.

6.    Klep pengaman, yaitu tempat uap air keluar berfungsi menjaga stabilitas tekanan tetap terbuka.

7.    Setelah air dari klep menetes, klep tersebut ditutup.

8.    Setelah klep tertutup, jarum penunjuk suhu dan tekanan akan bergerak menunjuk angka yang lebih besar karena suhu dan tekanan autoklaf naik.

9.    Bila jarum sudah menunjukkan angka 121^oC/15 lbs, kedudukan selama waktu sterilisasi yang diperlukan harus dijaga dengan cara mengukur besar kecilnya pemanasan.

10. Setelah sterilisasi selesai dilakukan, listrik/api dimatikan tapi jarum penunjuk dibiarkan kembali ke nol dengan sendirinya (jangan dipaksakan ).
11. Setelah jarum penunjuk kembali ke nol, klep dibuka dan tutup digeser lalu isi autoklaf dapat dikeluarkan.
12. Setelah selesai, tombol POWER dimatikan.

Cara kedua dengan perebusan akan dijelaskan sebagai berikut

1.    Didihkan air pada panci

2.    Masukkan alat – alat yang telah dipersiapkan dan tunggu beberapa saat

3.    Setelah selesai alat – alat diagkat dan dimasukkan ke dalam lemari penyimpnan.

D.        Sterilisasi Kering

1. Alat-alat (botol, cawan Petri, labu Erlenmeyer, dll) dicuci dengan deterjen

lalu dibilas sampai bersih, dikeringkan, dan dibungkus.

        2. Alat-alat tersebut dimasukan kedalam oven, suhu oven diatur 170-180^oC.

        3. Oven dipanaskan selama 2 jam. Kemudian alat-alat yang sudah steril dimasukan kedalam lemari steril, sedangkan botol steril siap digunakan untuk kemasan produk.

4. Tutup botol yang terbuat dari plastic cukup dicuci bersih kemudian  dibilas air panas.

BAB IV
HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Pengamatan

Tabel 1. Hasil Pengamatan Medium (Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2016)

Jenis Media	Bubuk			Larutan		Fungsi	Komposisi
	Warna	Aroma	Warna	Aroma	Setelah Sterilisasi
NA	Kuning	Biasa	Kuning Bening	Menyengat	Kuning sedikit pekat	Pertumbuhan mayoritas mikroorganisme heterotfof	5 g/L pepton daging; 3 g/L ekstrak daging; 12 g/L agar
PDA	Putih Tulang	Biasa	Kuning Lemon	Menyengat	Kuning sedikit pekat	Menumbuhkan dan mengidentifikasi kapang dan khamir	4g/L ekstrak kentang;20g/L Dekstrosa;15g/L Agar
PCA	Krem	Menyengat	Kuning	Sangat Menyengat	Putih		5g/L tripton;2,8g/L ekstrak yeast;1g/L glukosa;9g/L agar
EMB	Ungu	Biasa	Merah Keunguan	Menyengat	Merah Keunguan	Mendeteksi adanya bakteri E. coli	Pepton;Laktosa;Hidrogen;Dipotasium Phospat;Eosiny;Methilen Blue; Agar
NaCl Fisiologis	Putih	Garam	Bening	-	Bening	Sebagai pengencer serta antibiotik	Sodium Klorida

4.2. Pembahasan

4.2.1. Media

            Semua makhluk hidup di dunia sudah pasti memerlukan tempat untuk tumbuh dan berkembang sesuai dengan habitat serta keberadaan makanan. Hal ini berlaku juga untuk mikroorganisme. Saat seseorang akan menumbuhkan mikroorganisme, hal yang harus dilakukan adalah menyiapkan tempat tumbuh serta nutrisi yang dibutuhkan mikroorganisme yang akan dibiakkan yaitu substrat yang kemudian disebut media/medium. Media berguna untuk membantu menumbuhkan mikroba, mengisolasi, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi, serta melakukan perhitungan jumlah mikroba (Adityawarman, 2011). Media kultur dapat berbentuk cair, semi padat, dan padat (Afrianto, 2008).

            Agar merupakan ekstrak rumput laut dengan kandungan karbohidrat yang didominasi oleh galaktosa dan tidak mengandung nutrisi. Media padat setidaknya membutuhkan 1.5% hingga 1.8% agar. Sedangkan media semi padat hanya membutuhkan kurang dari 1% agar. Media yang berwujud cair tidak mengandung agar sebagai pengental dan biasa disebut dengan medium kaldu (broth medium). Penambahan agar akan membuat medium berbentuk semi padat atau padat. Agar adalah agen pengental yang baik. Agar dapat mencair pada suhu 100°C dan mengental pada suhu 40°C. Apabila akan dilakukan kultur, lebih baik dilakukan dalam suhu 37.5°C atau sedikit lebih tinggi sehingga medium tidak mencair (Afrianto, 2008).

            Media juga dibagi menjadi media umum dan media khusus. Media umum adalah media yang ditambahkan bahan-bahan stimulan pertumbuhan mikroba secara umum seperti karbohidrat, glukosa dan sejenisnya, serta nutrien lainnya. Media khusus dapat membantu mengisolasi dan mengidentifikasi mikroba spesifik. Untuk tujuan khusus, media dibagi menjadi 4, yaitu media selektif, media diferensia, media enrichment, dan media kombinasi selektif dan diferensial (Afrianto, 2008). Media selektif dibuat dengan penambahan senyawa kimia yang dapat menghambat satu kelompok mikroba yang lain namun memacu pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Sedangkan media diferensia mengandung bahan tambahan yang dapat menyebabkan perubahan warna media apabila terjadi reaksi kimia tertentu. Media tersebut digunakan untuk membedakan bakteri berdasarkan karakteristik biokimianya. Media enrichment atau diperkaya adalah media yang mengandung aditif yang menghambat pertumbuhan dan membantu meningkatkan pertumbuhan mikrooganisme tertentu yang jumlahnya sedikit dalam suatu campuran. Media ini hampir mirip dengan media selektif, perbedaannya terletak pada jenis zat kimia yang ditambahkan pada media. Kombinasi media selektif dan diferensia memungkinkan menghambat pertumbuhan mikroba satu dengan pertumbuhan lainnya (Afrianto, 2008).

            Dalam praktikum ini, dilakukan pembuatan beberapa medium yaitu Nutrient Agar (NA), Potato Dextrose Agar (PDA), Plate Count Agar (PCA), Eosin Methylene Blue (EMB), dan pengencer NaCl Fisiologis.

4.2.1.1. Nutrient Agar (NA)

             Nutrient Agar (NA) adalah medium umum untuk uji air dan produk diary. NA banyak digunakan untuk pertumbuhan mayoritas mikroorganisme yang tidak selektif atau disebut juga mikroorganisme heterotrof. NA matriks mengandung pepton 15.0 g/L, ekstrak ragi 3.0 g/L, sodium klorida 6.0 g/L, dekstrosa 1.0 g/L, dan agar 12.0 g/L.Ekstrak ragi berguna untuk sumber karbohidrat bagi mikroorganisme. Agar berfungsi sebagai pemadat medium serta aquades sebagai pelarutnya. Adanya pepton pada NA sangat baik untuk mikroba untuk cepat tumbuh karena mengandung banyak unsur Nitrogen (Dwidjooseputro, 1994). NA juga dapat digunakan untuk mengulturasi Enterobacteriacease, Pseudomonas spp, Staphylococcus spp, dan  Streptococcus spp (Niedersterbruch, 2013). Selain itu, media umum ini digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa stok kultur, pertumbuhan sampe pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni.

            Pada botol NA, tertera bahwa penggunaan sebanyak 20 gram untuk satu liter. Sehingga, dalam penggunaan volume tertentu (praktikum ini memerlukan 20 ml NA) dengan rumus pengenceran m1V1 =m2V2 diperlukan 0.4 gram bubuk agar NA.

            Rumus yang digunakan adalah rumus umum pengenceran dan digunakan dalam pengenceran media manapun. Dengan perhitungan tersebut, disiapkan 0,4 gram bubuk NA yang diukur dengan neraca analitik menggunakan beaker glass. Kemudian diencerkan dengan aquades pada erlenmeyer hingga volume menjadi 20 ml. Setelah itu, erlenmeyer ditutup sumbat cotton lalu ditutup kembali dengan alumunium voil untuk menjaga uap air tidak masuk karena autoclave termasuk sterilisasi basah.

4.2.1.2. Potato Dextrose Agar (PDA)

             Potato Dextrose Agar adalah media komplek dan media diferensial untuk pertumbuhan jamur dan ragi sehingga sering digunakan sebagai uji untuk menentukan jumlah jamur dan ragi dengan menumbuhkan mikroba pada permukaan media yang kemudian terbentuk koloni yang dapat diikat dan dihitung (Fardiaz, 1992). PDA mengandung 1.5% agar, 2% dekstrosa, serta nitrogen, fosfor, citamin, dan mikronutrien dari ekstrak kentang yang kemudian dapat disimpulakan 0,4% ekstrak kentang (Griffith, 2007). Dekstrosa pada PDA berguna sebagai sumber karbon, sedangkan ekstrak kentang tersebut memenuhi sebagian besar makro dan mikronutrien yang dibutuhkan mikroorganisme. (Rizaki, 2015). Dengan adanya sumber karbohidrat dan glukosa serta makro dan mikronutrien yang umum terdapat pada tanah, PDA dijadikan medium isolasi dan identifikasi pada mikrofungi berupa kapang dan khamir dan tidak baik untuk bakteri sehingga dapat digolongkan sebagai media khusus diferensial. Seperti yang tertera pada botol (39 gram untuk 1 liter), menurut perhitungan dasar pengenceran, diperlukan 0.78 gram bubuk PDA untuk 20 ml aquades.

            Resep pembuatan PDA adalah dari 100 gram kentang segar yang dikupas, lalu diiris dan dihomogenkan dengan 300 ml air kran, diblender, kemudian didiamkan semalam dengan suhu 41°C, sebelum difiltrasi dengan muslin. Dengan total 230 ml ekstrak kentang, 20 gram glukosa, 15 gram agar dicampurkan sebelum mencapai 1 liter. Kemudian disterilisasi dengan autoclave dalam 121°C selama 15 menit sebelum diaplikasikan ke cawan petri. Dalam beberapa kasus, air destilasi digunakan untuk mencegah kontaminasi dari berbagai macam logam yang ada pada air kran. (Griffith, 2007).

4.2.1.3. Plate Count Agar (PCA)

           PCA digunakan sebagai medium bagi mikroba dengan inokulasi diatas permukaan. PCA merupakan media padat yang baik bagi pertumbuhan hampir semua jenis mikroba karena mengandung komposisi casein enzymichydrolisate yang menyediakan amino dan substansi nitrogen kompleks lainnya serta ekstrak yeast demi suplai vitamin B kompleks. Seperti yang tertera pada botol PCA, PCA mengandung tripton 5.0 g/L, ekstrak yeast 2.8g/L, glukosa 1.0g/L, serta agar 9.0g/L. Selain itu, perhitungan pengenceran PCA dengan petunjuk pada botol (1,75 gram untuk 1 liter) sehingga dibutuhkan 0.35 gram untuk 20 ml aquades.

4.2.1.4. Eosin Methylene Blue (EMB)

   Media Eosin Methylene Blue mempunyai keistimewaan karena mengandung laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasi laktosa seperto E. Coli dengan mikroba yang tidak memfermentasikan laktosa seperti S. aureus, P. aeruginosa, dan Salmonella. Mikroba yang memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam, sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Adanya eosin dan methylene blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun, jika media ini digunakan pada tahap awal, karena mikroba lain juga tumbuh terutama P. aeruginosa dan Salmonella sp, dapat menimbulkan keraguan. Bagaimanapun media Eosin Methylene Blue sangat baik untuk mengonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E. Coli (Afrianto, 2008).

            Seperti yang tertera pada botol, Eosin Methylene Blue mengandung pepton, laktosa, hidrogen, dipotasium fosfat, eosiny, methylene blue, serta agar sehingga EMB termasuk media padat. Dalam petunjuk penggunaannya, tertera 500 gram untuk 13.300 liter, sehingga dibutuhkan 0.7 gram bubuk EMB untuk dilarutkan dengan 20ml aquades.

4.2.1.5. Physiological Natrium Chloride (NaCl Fisiologis)

NaCl digunakan sebagai larutan pengencer agar suspensi sampe tetap steril dan menghindari adanya kontaminan pada sampel. Selain itu, NaCl Fisiologis yang memiliki kandungan sodium klorida juga dapat mempertahankan kondisi pH.Prinsip pengenceran adalah menurunkan jumlah mikroba sehingga semakin banyak jumlah pengencer, semakin sedikit jumlah mikroba yang didapat. Dalam beberapa kasus, dapat terjadi hanya ada satu mikroba dalam satu tabung (Waluyo, 2004). NaCl Fisiologis (umumnya 0.9% - 1.2%) merupakan larutan elektolit garam yang umumnya memiliki mol sangat kecil (± 0.2%) dan kandungan klorida yang justru membantu mikroba untuk menyeimbangkan elektrolit sel dengan lingkungan sehingga mencegah sel mikroba mengalami lisis.

            Pada botol NaCl-Fis, tertera petunjuk penggunaan yaitu 0.85 gram untuk 100 ml. Sehingga, diperoleh perhitungan membutuhkan 0.17 gram bubuk NaCl fisiologis untuk 20 ml aquades.

4.2.2. Sterilisasi

 Sterilisasi adalah proses menghilangkan mikroba, spora, dan kontaminan lainnya dengan cara pemanasan. Semua material sebagai subjek proses ini disebut bahan steril. Terdapat dua pengertian mengenai steril, yaitu steril mutlak dan steril komersial. Steril mutlak adalah kondisi steril saat benar-benar tidak ada kehidupan dalam benda tersebut. Steril mutlak umumnya diaplikasikan pada alat laboratorium, kemasan bahan pangan, dan lainnya. Bila steril mutlak dilakukan terhadap bahan pangan, kerusakan komponen bahan pangan dapat terjadi dan hal tersebut tentunya tidak diinginkan. Steril komersial yang umumnya dilakukan terhadap bahan pangan ini bermaksud untuk mematikan mikroorganisme pathogen beserta sporanya tanpa merusak komponen bahan pangan.

            Terdapat macam-macam teknik sterilisasi yang dapat dilakukan dalam laboratorium mikrobiologi yaitu:

4.2.2.1. Pemanasan dengan Api

            Pemijaran dapat langsung membunuh mikroorganisme. Umumnya, pemijaran termasuk sterilisasi mutlak karena berlaku untuk alat-alat laboatorium saja seperti ose, jarum inokulum atau spreader, dan lain sebagainya. Dalam laboratorium, sumber api yang digunakan adalah bunsen burner, pembakar spirtus, atau  loop incinerator berupa tabung keramik panas hingga 815°C dan hanya membutuhkan 6 detik untuk sterilisasi.

4.2.2.2. Pemanasan Kering

            Mikroorganisme dapat mengalami kekeringan bila dipanaskan pada suhu tinggi sehingga sel akan lisis. Jika sterilisasi ini tidak maksimal (kurang panas), kemungkinan masih adanya endospora lebih besar. Pemanasan kering menggunakan oven. Oven mampu menjaga suhu pada 160°C hingga 170°C. Umumnya, alat yang disterilkan menggunakan oven adalah alat gelas seperti cawan atau pipet ikur dan bukan alat berbahan plastik atau karet. Sterilisasi dilakukan pada suhu tersebut hingga 1-2 jam atau 180°C selama 30 menit dengan 1 jam waktu pendinginan. Oven yang baik memiliki termometer atau alat perekam temperatur dan dilengkapi indikator waktu dan pemrograman waktu. Setelah sterilisasi, usahakan untuk tidak segera mendinginkannya diluar untuk mencegah keretakan gelas, atau harus didiamkan dahulu di dalam oven beberapa waktu.

4.2.2.3. Uap Air Panas

            Cara ini menggunakan prinsip yang berbeda dengan pemanasan lainnya. Uap air panas mampu membunuh mikroorganisme dengan menonaktifkan enzim-enzimnya sehingga metabolisme berhenti bekerja. Alat yang digunakan dalam sterilisasi ini adalah steamers  dan water bath. Keduanya memiliki prinsip teknik sama yaitu sebuah wadah yang menampung air dengan elemen pemanas dan bertutup. Uap air yang dihasilkan berada pada tekanan atmosfer. Water bath mampu memanaskan air hingga atau hampir mendekati titik didih dengan atau tanpa menghasilkan uap air. Hal yang perlu diperhatikan adalah penjagaan batas air minimal sesuai manual sehingga menutupi elemen pemanas. Pencairan kembali media agar steril dapat dilakukan pada water bath dengan suhu 47°C hingga 50°C. Media harus diangkat segera setelah semua mencair dan digunakan tidak melebihi waktu simpan 4 jam. Steaming yang dikembangkan John Tyndall juga merupakan cara sterilisasi uap air panas yang dapat mencapai suhu 100°C pada wadah tanpa tekanan. Sterilisasi ini dapat dilakukan sekali atau tiga kali (tahap) dengan hari yang berbeda dengan memanaskannya pada suhu 80°C selama satu jam (Barrow dan Feltham, 1993). Sedangkan, tindalisasi dilakukan pada suhu 90-100°C selama  30 menit secara bertahap tiga kali. Selama jeda, tahapan media diinkubasi pada 37°C semalam. Pemanasan tiga tahap dimaksudkan untuk memberi kesempatan endospora untuk berkembang sehingga akan mati pada tahap pemanasan selanjutnya (Hogg, 2005).

4.2.2.4. Uap Air Panas Bertekanan

            Uap air panas bertekanan lebih efisien dan penetratif dalam membunuh mikroorganisme. Tekanan yang paling efisien yaitu 103 kPa (15 Psi) selama 15 menit yang dapat dilakukan dengan autoklaf. Menurut Morello (2003), tekanan yang digunakan untuk sterilisasi pada umumnya 15 Psi atau 1 atm dengan suhu 121°C . Sehingga, tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda mencapai 15 pon tiap inchi². Autoklaf menggunakan uap air murni yang lebih ringan dan panas daripada udara untuk sterilisasi sehingga udara yang terdapat dalam wadah harus dikeluarkan. Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf akan mendidih dan uap air terbentuk lalu mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. Saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai, proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. Setelah sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga sama dengan atmosfer. Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan turun hingga nol. Hal yang sering terjadi adalah dengan menutup semua katup rapat-rapat sebelum udara dalam wadah tergantikan oleh uap air, ini adalah perbuatan yang salah. Adanya udara dalam wadah saat sterilisasi dapat mengakibatkan kurang efisiennya sterilisasi sehingga autoklaf hanya mencapai suhu maksimal pada kondisi uap air murni saja.

            Autoklaf juga digunakan untuk dekontaminasi. Dekontaminasi adalah sterilisasi terhadap semua biakkan hasil analisis atau yang telah tumbuh pada media. Dalam proses sterilisasi diperpanjang waktunya menjadi minimal 30 menit pada 121°C  atau 10 menit pada 126°C .

4.2.2.5. Penyinaran/Radiasi

            Salah satunya adalah radiasi non-ionisasi seperti sinar UV. Sinar UV dapat digunakan secara fisik yaitu dengan memaparkan alat atau bahan kepada sinar UV dengan waktu tertentu. Panjang gelombang yang umum dipakai adalah 260 nm karena panjang gelombang ini mampu merusak komponen asam nukleat berupa purin dan pirimidin dan asam amino aromatik pada protein. Energi yang diabsorbasi merusak ikatan kimia komponen tersebut sehingga tidak berfungsi secara normal. Penetrasi sinar UV sangat lemah, selembar kertas atau lapisan tipis kaca dapat menghalanginya sehingga aplikasi praktisnya adalah mensterilisasi permukaan meja kerja atau untuk air pada pengolahan air. Radiasi menggunakan sinar gamma yaitu radiasi ionisasi. Sinar gamma memiliki panjang gelombang yang lebih pendek dengan energi yang lebih besar sehingga memberi kekuatan penetrasi yang baik. Efek dari radiasi ionisasi adalah terbentuknya radikal bebas yang sangat reaktif sehingga merusak struktur makromolekul seperti DNA dan protein.

4.2.2.6. Sterilisasi Kimia

            Sterilisasi juga dapat dilakukan dengan menambahkan zat kimia antibakteri pada bahan atau alat. Umumnya jenis zat kimia yang digunakan adalah alkohol atau ethanol sebagai disinfektan dengan konsentrasi dibawah 100%. Konsentrasi yang sering digunakan untuk disinfektan adalah 70%. Selain mendenaturasi protein, alkohol dapat melarutkan lemak sehingga berpengaruh terhadap membran sel dan kapsul beberapa jenis virus. Sel vegetatif dan hifa dapat dimatikan dengan alkohol, namun spora kadang resisten. Alkohol digunakan sebagai pelarut disinfektan lain seperti iodin yang dapat meningkatkan efektivitas disinfeksinya.

            Selain alkohol, halogen atau klorin juga efektif sebagai disinfeksi dalam bentuk gas bebas dan sebagai senyawa pelepas klorin seperti klotir dan kloramin. Senyawa yang lebih stabil lainnya yaitu kloramin yang memiliki keunggulan lebih tahan terhadap bahan organik sehingga lebih tidak beracun dan mampu melepas klorin secara perlahan sehingga memperpanjang efek bakterisidal disinfektan ini. Jenis halogen lainnnya adalah iodin dengan daya kerja bereaksi dengan residu tirosin pada protein. Selain itu, ada juga senyawa fenol dengan gugus asam karboksilat yang memiliki daya kerja merusak protein dan membran sehingga fenol dapat tetap aktif walaupun terdapat senyawa organik dan detergen.

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

1.      Media berguna untuk membantu menumbuhkan mikroba, mengisolasi, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi, serta melakukan perhitungan jumlah mikroba.

2.      Media kultur dapat berbentuk cair, semi padat, dan padat berdasarkan komposisi agarnya.

3.      Media umum adalah media yang ditambahkan bahan-bahan stimulan pertumbuhan mikroba secara umum.

4.      Media khusus dapat membantu mengisolasi dan mengidentifikasi mikroba spesifik.

5.      Media NA padat banyak digunakan untuk pertumbuhan mayoritas mikroorganisme yang tidak selektif atau disebut juga mikroorganisme heterotrof.

6.      Potato Dextrose Agar adalah media kompleks dan media diferensial untuk pertumbuhan jamur dan ragi sehingga sering digunakan sebagai uji untuk menentukan jumlah jamur dan ragi.

7.      PCA merupakan media umum padat yang baik bagi pertumbuhan hampir semua jenis mikroba.

8.      Media Eosin Methylene Blue mengandung laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasi laktosa seperti E. Coli.

9.      NaCl Fisiologis merupakan larutan elektrolit garam dengan kandungan klorida yang membantu mikroba menyeimbangkan elektrolit sel dengan lingkungan sehingga mencegah lisis sel.

10.  Sterilisasi adalah proses menghilangkan mikroba, spora, dan kontaminan lainnya dengan cara pemanasan.

11.   Steril mutlak adalah kondisi steril saat benar-benar tidak ada kehidupan dalam benda tersebut. Steril komersial bertujuan mematikan mikroorganisme pathogen beserta sporanya tanpa merusak komponen bahan pangan.

12.  Sterilisasi dapat dilakukan dengan pemanasan pijar api, pemanasan kering, pemanasan uap air panas, pemanasan uap air panas bertekanan, penyinaran/radiasi,  dan sterilisasi kimia

5.2. Saran

1.      Praktikan terlebih dahulu sudah memahami cara sterilisasi dan berbagai macam medium yang akan digunakan.

2.      Alat dan daerah kerja harus dalam keadaan bersih (meskipun tidak steril) sehingga pengerjaan lebih efisien.

3.      Alat pengukuran yang digunakan harus dipersiapkan agar tidak menimbulkan keraguan dalam perhitungan dan pengenceran.

4.      Praktikan terlebih dahulu memahami teknik penggunaan autoklaf sehingga sterilisasi menjadi optimal.

DAFTAR PUSTAKA

Adityawarman, A. C. 2011. Teknik Pengolahan Daging. Terdapat pada: http://www.academia.edu   (diakses pada tanggal 26 Maret 2016 pukul 16.39 WIB)

Afrianto, Eddy. 2008. Pengawasan Mutu Bahan/Produk Pangan Jilid 2 untuk       SMK. Direktorat Pembinaan Sekolah Menengah Kejuruan, Jakarta.

Barrow, GI dan RKA Feltham. 1993. Cowan and Steel’s, Manual for The Identification of Medical Bacteria. Cambridge University Press, New York

Dwidjoseputro, D.  1994.  Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.

Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan 1. Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi.       Fateta IPB, Bogor.

Griffith, Garth W. 2007. Copper deficiency in potato dextrose agar causes reduced           pigmentation in cultures of various fungi.  FEMS Microbiology Letters :             276 : 165-171.

Hogg, Stuart. 2005. Essential Microbiology. John Wiley and Sons, Chicester.

J. Pelczar, Micheal. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta.

Morello, JA, PA Granato, HE Mizer.  2003. Laboratory Manual and Workbook in             Microbiology, Application to Patient Care. 7: Mc Graw Hill Companies.            (tempat tidak diketahui)

Niederstebruch, N. dan Sixt, D. 2013. Standard Nutrient Agar 1 as a substitute for            blood-supplemented Müller–Hinton agar for antibiograms in developing   countries.  European Journal Of Clinical Microbiology & Infectious        Disease : 21 : 237-241.

Pratiwi T., Sylvia. 2008. Mikrobiologi Farmasi.  Penerbit Erlangga, Jakarta

Pradhika, Indra.  2014.  Sterilisasi. Terdapat pada :   http://mikrobiologipraktik.com/sterilisasi/  (diakses pada tanggal 26 Maret          2016 pukul 23:36 WIB)

Rizaki, Nara. 2015. Nutrien Agar. Terdapat pada :    http://documents.tips/documents/nutrien-agar.html (diakses pada tanggal    26 Maret 2016 pukul 13.47 WIB).

 Rovná, Katarína; Bakay, Ladislav; Petrová, Jana; Terentjeva, Margarita; Cerná,      JanaView Profile; et al. 2015. Characterization of endophytic microflora     of Rosa canina fruits.  The Journal of Microbiology, Biotechnology and             Food Sciences : 4: 65-68.

Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. UMM Press, Malang.

LAMPIRAN

JAWABAN DAN PERTANYAAN

1. Setelah saudara pelajari dan dipraktekkan, jelaskan fungsi penambahan beef extract pada pembuatan media NA dan fungsi penambahan kentang pada pembuatan media PDA! Mengapa berbeda?

Fungsi penambahan beef extract pada pembuatan media NA adalah untuk menambahkan nutrisi untuk pertumbuhan bakteri seperti protein dan beberapa vitamin kompleks lainnya.  Penambahan kentang berfungsi sebagai sumber karbohidrat dalam jumlah cukup sehingga baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir tetapi kurang baik untuk pertumbuhan bakteri karena terdapat senyawa yang bersifat asam pada kentang yang sangat sensitif untuk kentang. NA lebih dominan untuk pertumbuhan bakteri sedangkan PDA  untuk pertumbuhan kapang dan khamir.

2. Jelaskan fungsi dari larutan pengencer? Mengapa harus menggunakan KH₂PO₄?  Dapatkah digantikan senyawa kimia lain?

Fungsi dari larutan pengenceran adalah menurunkan jumlah mikroba sehingga semakin banyak jumlah pengenceran yang dilakukan,  makin sedikit jumlah mikroba. Jumlah mikroba terbaik untuk dapat dihitung yaitu antara 30 sampai 300 sel mikroba per ml. Larutan pengencer harus menggunakan KH₂PO₄ karena kalium dan fosfatnya berguna untuk member nutrisi sel mikroorganisme. Larutan pengencer dapat diganti air sadah yang umumnya mengandung ion kalsium dan magnesium yang tinggi.